9-5. cDNAの合成

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RNAを鋳型に逆転写酵素で一本鎖の相補的DNA(cDNA)をつくり、それを二本鎖cDNAに変換してベクターに組込む

cDNA合成はタンパク質産生に必須の技術

1) 真核生物mRNAの調製

mRNA由来cDNAを得るためにはmRNAの精製が必要となる

真核生物のmRNAは5'末端にキャップ構造、3’末端にポリA鎖をもつので、ポリA鎖のついたRNAを塩存在下でオリゴdTセルロースなどに結合させ、水で溶出すると精製mRNAが得られる

2) cDNAの合成

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一本鎖目のDNA合成

全長に近いcDNAがほしい場合は、ポリA鎖にアニールするオリゴdTをプライマーに使う

逆転写酵素はRNaseH活性をもつので、反応に伴って、鋳型RNAが切断・分解されていく

ポリA鎖のないRNAを鋳型にする場合はランダムプライマーで合成を始める

RNaseHがcDNA合成中に働くと、鋳型RNAが切断されて長いcDNAができにくいため、遺伝子を改変してつくったRNaseH活性をもたない酵素が使われる場合もある

二本鎖目DNAの普遍的合成

断片化されてDNA上に残ったRNAがプライマーとして働くが、RNAをRNaseHかアルカリで積極的に断片化してプライマーにすることもある

RNAは酵素反応の過程で除かれる

完全長CDNAの合成

調製したmRNA標品中には断片化したものが多数あるため、オリゴdTからふつうにcDNA合成すると、RNAの5'末端側が失われた短いcDNAが大量にできてしまう

この問題を回避する方法の1つにオリゴキャップ法がある

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この方法では、cDNA合成の前にキャップをホスファターゼとピロホスファターゼを使って除き(ただし、リン酸基が1個は残る)、そこに特定のRNAオリゴ(ヌクレオチド)を連結する

一本鎖目cDNA合成はオリゴdTをプライマーにし、二本鎖目の合成はRNAオリゴとアニールする特定基配列のDNAオリゴをプライマーにする

両プライマーに制限酵素認識部位を入れておき、それを利用してベクターに組込む

特定部分の二本鎖合成

cDNA配列が既知で、cDNAの特異的領域を増幅したい場合は、既知配列をもとにした特定のプライマーでDNAを合成する